植物提取物與畜禽腸道健康
1 腸道免疫系統(tǒng)
腸道上皮免疫系統(tǒng)按照功能分為免疫誘導(dǎo)部位和效應(yīng)部位。誘導(dǎo)部位主要為PP結(jié)，效應(yīng)部位主要包括腸粘膜上皮內(nèi)和固有層的淋巴細胞(圖1)。小腸PP結(jié)是小腸內(nèi)淋巴濾泡的集合體，主要由T、B淋巴細胞(CD4+)組成。在PP結(jié)的淋巴濾泡中含有大量免疫細胞，受抗原刺激形成效應(yīng)中心，B淋巴細胞及增殖淋巴母細胞主要聚集于此，并多數(shù)為IgA+細胞，濾泡間區(qū)含有少量IgM+和IgD+細胞。T、B淋巴細胞在此分化成熟，并移行到粘膜的相應(yīng)位置發(fā)揮其免疫效應(yīng)。
1.1 腸道特異性免疫腸道特異性免疫分為體液免疫和細胞免疫。參與免疫的主要效應(yīng)細胞包括效應(yīng)T細胞、效應(yīng)B細胞、漿細胞、巨噬細胞、肥大細胞和自然殺傷細胞（NK），主要的輔助細胞主要有M細胞、樹突狀細胞（DC）和巨噬細胞。
1.1.1 體液免疫
體液免疫是腸道免疫的主要過程，產(chǎn)生SIgA。此過程中，M細胞擔(dān)任著免疫的門戶，進入腸道的細菌、病毒等抗原首先被M細胞捕獲，并轉(zhuǎn)移給淋巴濾泡中的巨噬細胞。未清除的抗原被提交到上皮淋巴組織處，激活淋巴組織內(nèi)的T、B細胞，被激活的T、B細胞通過血液循環(huán)，到達腸道固有層與相關(guān)腺體處。腸道固有層是粘膜免疫的主要效應(yīng)部位，B細胞定居于固有層，在抗原、細胞因子及輔助性T細胞(Th)的刺激下增殖分化為成熟的IgA漿細胞。漿細胞分泌的IgA通過J鏈鏈接的二聚體與分泌成分結(jié)合構(gòu)成SIgA，分泌到粘膜表面，發(fā)揮著阻止病原體黏附或進入粘膜上皮、溶解細菌以及中和病毒等作用。
1.2.2 細胞免疫
粘膜固有層細胞包括上皮內(nèi)淋巴細胞（IEL）、T細胞、K細胞、巨噬細胞、NK細胞等在內(nèi)的固有層免疫細胞構(gòu)成了腸道細胞免疫。IEL中90%是CD3+T細胞，其中CD4+T細胞主要起輔助與誘導(dǎo)的作用。CD8+細胞負責(zé)對靶細胞的清除，主要起著抑制和毒殺的作用。腸道粘膜中CD4+T細胞可促進IgA的合成，CD8+細胞起到抑制作用。同時T細胞分泌的細胞因子如IL-4、IL-13等對粘膜化學(xué)屏障，特別是黏液與黏蛋白的分泌起到促進作用。
1.2 腸道粘膜非特異性免疫屏障
非特異性腸道粘膜免疫屏障是腸道免疫的天然屏障，主要包括腸道物理屏障、化學(xué)屏障和微生物屏障（圖2）。各個屏障通過不同的分子機制、信號通路及生物學(xué)功能，發(fā)揮著抵抗外來抗原與病原菌的黏附與入侵，對機體起到初步的免疫防御作用。
1.2.1 腸道粘膜物理屏障
物理屏障又稱機械屏障，由腸粘膜上皮細胞及其間緊密連接組成的腸道上皮完整的結(jié)構(gòu)組成，是腸道屏障中尤為重要的一部分。腸道上皮細胞緊密排列，通過細胞間連接復(fù)合體調(diào)控細胞旁路通透性和上皮屏障的完整性。這些鏈接復(fù)合體包括緊密連接(TJ)、黏著連接(AJ)、橋粒(desmosome)和間隙連接(GJ)等(圖3)。TJ是阻止腸毒素進入組織、封閉細胞間隙的重要結(jié)構(gòu)；AJ位于緊密連接下方，在細胞間的黏附與胞內(nèi)信號傳遞上起著作用；橋粒則起到鏈接相鄰細胞的作用；GJ可在細胞間形成電偶聯(lián)和代謝偶聯(lián)，對神經(jīng)沖動傳遞起作用，并連通細胞，形成胞間小分子代謝物和信號分子的水性通道。TJ在免疫屏障中起重要作用，其通透性決定著整個腸道上皮屏障的功能。研究發(fā)現(xiàn)，TJ主要有3種整合蛋白，即閉鎖蛋白(occluding)、閉合蛋白(claudin)和連接黏附分子(JAM)；前兩者主要負責(zé)相鄰兩個細胞間小分子物質(zhì)擴散與通透性的調(diào)控；JAM在免疫監(jiān)視和炎癥反應(yīng)期間，對免疫細胞的運輸非常重要。
非特異性腸道粘膜免疫屏障是腸道免疫的天然屏障，主要包括腸道物理屏障、化學(xué)屏障和微生物屏障（圖2）。各個屏障通過不同的分子機制、信號通路及生物學(xué)功能，發(fā)揮著抵抗外來抗原與病原菌的黏附與入侵，對機體起到初步的免疫防御作用。
1.2.1 腸道粘膜物理屏障
物理屏障又稱機械屏障，由腸粘膜上皮細胞及其間緊密連接組成的腸道上皮完整的結(jié)構(gòu)組成，是腸道屏障中尤為重要的一部分。腸道上皮細胞緊密排列，通過細胞間連接復(fù)合體調(diào)控細胞旁路通透性和上皮屏障的完整性。這些鏈接復(fù)合體包括緊密連接(TJ)、黏著連接(AJ)、橋粒(desmosome)和間隙連接(GJ)等(圖3)。TJ是阻止腸毒素進入組織、封閉細胞間隙的重要結(jié)構(gòu)；AJ位于緊密連接下方，在細胞間的黏附與胞內(nèi)信號傳遞上起著作用；橋粒則起到鏈接相鄰細胞的作用；GJ可在細胞間形成電偶聯(lián)和代謝偶聯(lián)，對神經(jīng)沖動傳遞起作用，并連通細胞，形成胞間小分子代謝物和信號分子的水性通道。TJ在免疫屏障中起重要作用，其通透性決定著整個腸道上皮屏障的功能。研究發(fā)現(xiàn)，TJ主要有3種整合蛋白，即閉鎖蛋白(occluding)、閉合蛋白(claudin)和連接黏附分子(JAM)；前兩者主要負責(zé)相鄰兩個細胞間小分子物質(zhì)擴散與通透性的調(diào)控；JAM在免疫監(jiān)視和炎癥反應(yīng)期間，對免疫細胞的運輸非常重要。
1.2.2 腸道粘膜化學(xué)屏障
腸粘膜化學(xué)屏障主要是指覆蓋在腸上皮細胞的黏液層。黏液層是由腸黏液腺和上皮杯狀細胞產(chǎn)生的，附著在粘膜表面一定厚度的疏水黏液被，其主要成分為黏蛋白(MUC)、SIgA、水、電解質(zhì)，并伴有細胞碎片與常駐菌群。黏液被覆蓋在粘膜表面，遮蓋了粘膜表面的糖蛋白和糖脂受體，阻止了細菌的附著；黏液中的糖蛋白和糖脂則充當(dāng)了細菌黏附受體的類似物，改變了細菌的進攻位點，使細菌結(jié)合到黏蛋白和糖脂上，并隨糞便排出體外；同時黏液保護上皮細胞不受腸腔滲透壓的影響。
1.2.3 腸道粘膜微生物屏障
微生物屏障是腸道內(nèi)正常菌群在腸道內(nèi)定植形成的微生態(tài)系統(tǒng)。研究表明，腸道內(nèi)厭氧菌能夠通過磷壁酸與腸粘膜上皮細胞結(jié)合，可有效阻止致病菌的定植與入侵；厭氧菌不僅產(chǎn)生維生素等供機體利用，而且產(chǎn)生的乳酸和短鏈脂肪酸等還可降低腸道pH，抑制致病菌生長；同時，常駐菌群多帶有抗原性，可刺激特異性免疫系統(tǒng)的成熟，抵御病原菌入侵。
1.2.3 腸道粘膜微生物屏障
微生物屏障是腸道內(nèi)正常菌群在腸道內(nèi)定植形成的微生態(tài)系統(tǒng)。研究表明，腸道內(nèi)厭氧菌能夠通過磷壁酸與腸粘膜上皮細胞結(jié)合，可有效阻止致病菌的定植與入侵；厭氧菌不僅產(chǎn)生維生素等供機體利用，而且產(chǎn)生的乳酸和短鏈脂肪酸等還可降低腸道pH，抑制致病菌生長；同時，常駐菌群多帶有抗原性，可刺激特異性免疫系統(tǒng)的成熟，抵御病原菌入侵。
2 植物提取物對腸道粘膜關(guān)鍵蛋白表達調(diào)控機制
2.1 對TJ的調(diào)控通路
TJ結(jié)構(gòu)的組裝、分解和維持受到各種病理性和病原性刺激物的影響，主要受到以下幾個信號通路的影響：蛋白激酶C（PKC），絲裂原激活的蛋白激酶（MAPKs），肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）以及GTP酶。PKC介導(dǎo)了多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,在上皮細胞中，對TLR2的刺激激活了PKCα與PKCδ蛋白，繼而增加了跨上皮細胞電阻和ZO-1的重新分配。MAPK可對各種刺激或生長因子做出響應(yīng)，其中細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）可直接作用于occludin蛋白的C-末端阻止過氧化氫誘導(dǎo)的TJ的斷裂，白藜蘆醇能夠活化PKC，增加MAPK的基因表達水平。MLCK是介導(dǎo)調(diào)控TJ滲透性多條通路的關(guān)鍵中間元件，影響TJ屏障的細胞因子、菌群等。Shen等發(fā)現(xiàn)，MLCK突變體的連續(xù)表達，導(dǎo)致了TEER的降低與ZO-1和occludin的重新分配。中藥提取物亦能夠提高TEER，降低細胞通透性，并可調(diào)節(jié)claudin-2保護Caco-2細胞的功能。GTP酶介導(dǎo)的TJ調(diào)控通路比較復(fù)雜，Rho的失活導(dǎo)致ZO-1與occludin背離細胞膜，導(dǎo)致TEER的降低與細胞旁路通量的增加。Rho的激活會使MLC磷酸化，增加了TJ的分解。植物提取物中的低聚糖能夠通過Rho相關(guān)激酶增強上皮細胞TJ功能的恢復(fù)。當(dāng)腸道炎癥發(fā)生時，TJ會受到影響。對于LPS誘導(dǎo)的損傷，黃芪苷與黃芪多糖均被證實能夠顯著提高ZO-1與occludin的mRNA水平，上調(diào)ZO-1的蛋白表達，并可恢復(fù)LPS造成的ZO-1的連接與分布，具有緩解腸道炎癥損傷的作用。
TJ結(jié)構(gòu)的組裝、分解和維持受到各種病理性和病原性刺激物的影響，主要受到以下幾個信號通路的影響：蛋白激酶C（PKC），絲裂原激活的蛋白激酶（MAPKs），肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）以及GTP酶。PKC介導(dǎo)了多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,在上皮細胞中，對TLR2的刺激激活了PKCα與PKCδ蛋白，繼而增加了跨上皮細胞電阻和ZO-1的重新分配。MAPK可對各種刺激或生長因子做出響應(yīng)，其中細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）可直接作用于occludin蛋白的C-末端阻止過氧化氫誘導(dǎo)的TJ的斷裂，白藜蘆醇能夠活化PKC，增加MAPK的基因表達水平。MLCK是介導(dǎo)調(diào)控TJ滲透性多條通路的關(guān)鍵中間元件，影響TJ屏障的細胞因子、菌群等。Shen等發(fā)現(xiàn)，MLCK突變體的連續(xù)表達，導(dǎo)致了TEER的降低與ZO-1和occludin的重新分配。中藥提取物亦能夠提高TEER，降低細胞通透性，并可調(diào)節(jié)claudin-2保護Caco-2細胞的功能。GTP酶介導(dǎo)的TJ調(diào)控通路比較復(fù)雜，Rho的失活導(dǎo)致ZO-1與occludin背離細胞膜，導(dǎo)致TEER的降低與細胞旁路通量的增加。Rho的激活會使MLC磷酸化，增加了TJ的分解。植物提取物中的低聚糖能夠通過Rho相關(guān)激酶增強上皮細胞TJ功能的恢復(fù)。當(dāng)腸道炎癥發(fā)生時，TJ會受到影響。對于LPS誘導(dǎo)的損傷，黃芪苷與黃芪多糖均被證實能夠顯著提高ZO-1與occludin的mRNA水平，上調(diào)ZO-1的蛋白表達，并可恢復(fù)LPS造成的ZO-1的連接與分布，具有緩解腸道炎癥損傷的作用。
2.2 對MUC2的調(diào)控通路
MUC2是腸道杯狀細胞產(chǎn)生的分泌型糖蛋白，是腸上皮黏液的主要成分，有著保護腸上皮的功能。腸道炎癥發(fā)生時，人參提取物能夠刺激粘膜上皮細胞，增加MUC3和MUC4的分泌水平，緩解腸炎。腫瘤抑制基因p53調(diào)節(jié)參與細胞周期進程，DNA修復(fù)，凋亡等許多生長控制基因的表達。研究證實，MUC2基因的啟動受到p53蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，細胞應(yīng)激可能通過p53產(chǎn)生MUC2促進受損細胞周圍保護屏障的構(gòu)建。植物中的活性成分，如茶多酚、黃酮能夠通過p53轉(zhuǎn)錄激活MUC2基因表達。MUC2等黏蛋白的表達還受到其他植物成分的影響，肉仔雞日糧中添加丹參精油后，回腸MUC及杯狀細胞的數(shù)量顯著提高；肉桂、百里香和姜黃提取物也被證實具有增加肉雞小腸MUC2基因表達和改善腸道消化和防御能力的作用。
MUC2是腸道杯狀細胞產(chǎn)生的分泌型糖蛋白，是腸上皮黏液的主要成分，有著保護腸上皮的功能。腸道炎癥發(fā)生時，人參提取物能夠刺激粘膜上皮細胞，增加MUC3和MUC4的分泌水平，緩解腸炎。腫瘤抑制基因p53調(diào)節(jié)參與細胞周期進程，DNA修復(fù)，凋亡等許多生長控制基因的表達。研究證實，MUC2基因的啟動受到p53蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，細胞應(yīng)激可能通過p53產(chǎn)生MUC2促進受損細胞周圍保護屏障的構(gòu)建。植物中的活性成分，如茶多酚、黃酮能夠通過p53轉(zhuǎn)錄激活MUC2基因表達。MUC2等黏蛋白的表達還受到其他植物成分的影響，肉仔雞日糧中添加丹參精油后，回腸MUC及杯狀細胞的數(shù)量顯著提高；肉桂、百里香和姜黃提取物也被證實具有增加肉雞小腸MUC2基因表達和改善腸道消化和防御能力的作用。
3 植物提取物對其他腸道主要免疫指標的影響
3.1 調(diào)控細胞因子分泌
細胞因子是多種免疫細胞應(yīng)答炎癥反應(yīng)時釋放的一類非抗體、非補體的能夠調(diào)節(jié)免疫功能，調(diào)節(jié)細胞生長分化，參與炎癥反應(yīng)的小分子多肽物質(zhì)。在腸道特異性免疫中IFN-γ、IL-2、IL-4等細胞因子具有特殊且重要的意義。IFN-γ參與誘導(dǎo)和增強機體的細胞免疫；IL-4參與促進B淋巴細胞的增殖分化，增強體液免疫。IFN-γ、IL-4的水平反映腸道細胞免疫與體液免疫的狀態(tài)。IL-2對免疫反應(yīng)的性質(zhì)有著顯著影響，有利于Th1和Th2細胞的免疫應(yīng)答。從枸杞與茯苓中提取的多糖能夠提高免疫抑制下小鼠腸道粘膜中IFN-γ和IL-4的分泌水平，維持腸道免疫處于相對穩(wěn)定狀態(tài)。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）是腸道內(nèi)誘導(dǎo)粘膜SIgA的重要物質(zhì)。Xie等發(fā)現(xiàn)口服白術(shù)多糖可顯著提高小鼠十二指腸中TGF-β和IL-6和TNF-α的mRNA的表達量。IL-17是促使白細胞處理炎癥的重要細胞因子，從淫羊藿提取的多糖可促進小腸IL-17分泌，提高腸道免疫。黃芪多糖能夠顯著下調(diào)體外培養(yǎng)的Caco2細胞中TNF-α、IL-1β和IL-8的分泌水平，緩解LPS對細胞的損傷。
3.2 提高腸道粘膜免疫SIgA分泌水平
腸道內(nèi)SIgA是腸道免疫非常重要的成分，由粘膜固有層的漿細胞分泌產(chǎn)生，并通過上皮細胞進入腸腔內(nèi)，為粘膜表面提供多重保護作用。并且它可以選擇性地轉(zhuǎn)移到其他粘膜組織，從而建立一種廣泛而穩(wěn)定的黏液屏障系統(tǒng)，防止病原微生物入侵。SIgA在中和腸道內(nèi)毒素，阻止病原侵入，抑制病原微生物在腸上皮細胞的黏附和定殖方面發(fā)揮重要的功能。且其分泌細胞數(shù)量也常被用作評價腸道粘膜免疫的指標，從中草藥中提取的多糖多具有提高小腸中IgA+分泌細胞數(shù)量的作用，在H22肝癌耐受小鼠中，靈芝多糖的添加能夠顯著增加小腸中IgA+細胞數(shù)量。此外據(jù)報道，SIgA能夠增強腸道黏液的親和力，調(diào)控IgG介導(dǎo)的反應(yīng)以助于隔離細菌與粘膜的接觸，并抑制感染部位的炎癥反應(yīng)，同時作為腸道分泌最多的免疫球蛋白，其分泌水平反映了粘膜免疫機制的成熟度，是腸道屏障功能的重要貢獻者。而植物提取物作為一種天然活性物質(zhì)在一定程度上能夠促進SIgA分泌，從淫羊藿提取的多糖可顯著提高肉仔雞十二指腸和空腸中SIgA的分泌，增強粘膜免疫。SIgA的分泌誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化受到TGF-β的調(diào)控，白術(shù)多糖能夠通過提高十二指腸中TGF-β基因表達水平而促進SIgA的分泌，提高粘膜免疫。
3.3 調(diào)節(jié)腸道粘膜微血管內(nèi)皮細胞NO的分泌量
NO是體內(nèi)非特異性防御反應(yīng)系統(tǒng)的組成部分，在血管調(diào)節(jié)、神經(jīng)信息的傳遞及免疫功能調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。在機體內(nèi)，NO通過非特異性殺傷寄生蟲、細菌、真菌及腫瘤細胞起到增強機體非特異性免疫的功能。NO能夠調(diào)控巨噬細胞的功能，抑制多種細胞因子如干擾素、白細胞介素、腫瘤壞死因子等的合成，保護胃腸主要細胞免于損傷，對粘膜防御具有重要的意義。但NO的調(diào)控具有雙向性，在腸道早期損傷時，NO起到保護腸道粘膜屏障的作用；在強炎癥時，抑制NO的合成可改善屏障紊亂。Guo等發(fā)現(xiàn)積雪草苷具有抗炎特性，能夠通過抑制NO的合成促進胃腸炎癥的愈合。NO合成酶（iNOS）抑制劑能夠阻止IFN-γ引起的腸道通透性的增加，紅葡萄酒中的多酚可通過抑制iNOS的基因表達水平來減少結(jié)腸腫瘤發(fā)生的幾率。此外，腸道黏液層是保護上皮細胞免于物理損傷，減少細菌對上皮的黏附和粘膜侵襲的重要屏障，低量NO能夠引發(fā)胃腸黏液的釋放。有研究表明，橡樹和石榴中的多酚提取物能夠降低體外培養(yǎng)的腸道Caco-2細胞中NO的合成量，緩解炎癥損傷。
3.4 對微生物菌群的影響
腸道微生物是腸道粘膜屏障的重要影響因素，它不僅構(gòu)成了粘膜微生物屏障，同時對腸道通透性，TJ的裝載、構(gòu)建以及MUC2的合成、分泌有著不可忽視的作用。植物提取物被畜禽攝入后，可以通過提高腸道上皮的免疫防御機制，抵抗病原微生物引起的腹瀉。研究表明，植物提取物的疏水性能夠使細菌細胞膜和線粒體膜上磷脂分開，破壞細胞結(jié)構(gòu)，增大通透性，引起胞內(nèi)離子等內(nèi)容物外流，最終導(dǎo)致細菌死亡。牛至中香芹酚可破壞綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌的磷酸分子，導(dǎo)致細菌失活。石榴提取物能夠增加糞便雙歧桿菌和乳酸菌數(shù)量，減少大鼠炎癥標志物。腸道菌群的改善不僅減少了腹瀉，對粘膜免疫屏障也起著重要的影響。腸道內(nèi)有益菌，如枯草芽孢桿菌的增多可以顯著改善腸道形態(tài)，提高杯狀細胞的數(shù)量，同時還能夠提高occludin、claudin-2與claudin-3的基因表達水平；乳桿菌能夠調(diào)控TJ蛋白組的特性，并對化學(xué)誘導(dǎo)的上皮屏障損傷起到保護作用。綠茶提取物和白藜蘆醇都可顯著增加腸道內(nèi)乳酸桿菌或雙歧桿菌的數(shù)量，改善腸道健康。在肉仔雞日糧中添加肉桂精油和牛至精油能夠顯著增加回腸絨毛高度和乳酸菌數(shù)量，減少回腸和盲腸內(nèi)容物中大腸桿菌數(shù)量。
4 小結(jié)
植物提取物特別是植物多糖、多酚、精油作為天然功能性飼料添加劑，在機體細胞免疫和腸道免疫方面均發(fā)揮著重要作用。但目前對植物提取物在畜禽腸道健康的研究大多停留在改善腸道內(nèi)環(huán)境、腸道結(jié)構(gòu)與微生物菌群方面，在改善腸道屏障、粘膜免疫，特別是包括緊密連接和黏蛋白在內(nèi)的對深層機理的研究尚且不足。探索植物提取物增強粘膜免疫的深層機理，對開發(fā)新型腸道健康促進劑，防治腸道疾病具有十分重要的意義。
參考資料：XIE Yuhuai, WANG Lixue, YANG Weiren, ZHANG Guiguo, ZHANG Chongyu, LIU Yanhua, ZHANG Jifu. Effect on livestock gut mucosal immunity of plant extract and its mechnism. Pratacultural Science, 2018,35(10): 2500-2511.
